2024-02-06 11:31:58
实验干货 | 细胞冻存与复苏实验指南(不看后悔!!!)

01

简介


细胞冻存与复苏是一种用于长期储存细胞的技术。在这个过程中,细胞被置于低温环境中,减缓其代谢活动。通过将细胞冷冻保存在液氮中(通常为-196℃),细胞暂时脱离生长状态,但其细胞特性得以保存。当需要时,可以通过复苏将这些冻存的细胞重新激活,以供实验使用。这种方法能够适度地保存一定数量的细胞,防止细胞受到污染或其他意外事件的影响,从而发挥了细胞保种的作用。


02

原理


细胞冻存原理:

细胞冻存的原理在于降低细胞温度至零度以下时,会引起以下变化:细胞器会脱水,细胞内可溶性物质浓度增加,并形成冰晶。


缓慢冷冻的过程可以逐渐使细胞脱水,以防止细胞内形成大冰晶。因为大冰晶可能导致细胞膜和细胞器的损伤和破裂。而快速复苏的目的是防止小冰晶再次结合成大冰晶,即防止冰晶的再结晶过程。


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图片来源网络


低温保护剂的应用原理:

1. 增加渗透压稳定性:在细胞冻存过程中,加入低温保护剂可以增加细胞的渗透压稳定性,从而减缓细胞在慢速降温过程中的脱水和皱缩现象,显著提高了冻存效率。


2. DMSO的作用:常用的低温保护剂是DMSO(二甲基亚砜),它是一种渗透性保护剂。DMSO能够迅速透入细胞,并提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓了冻结过程。这样一来,细胞在冻结前会透出水分到细胞外部,在细胞外形成冰晶,从而减少了细胞内部的冰晶形成,有效减少了冰晶对细胞的损伤。


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图片来源网络


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实验步骤


1

材料准备

1.仪器:净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱(4℃、-20℃、-70℃)、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。


2.玻璃器皿:吸管(弯头、直头)、培养瓶、玻璃瓶(250 ml、100 ml)、废液缸。


3.塑料器皿:吸头、枪头、胶塞、移液管(10 ml)、15 ml 离心管、冻存管(1~2 ml)。


4.其他物品:微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。


5.试剂:D-Hanks 液、小牛血清、培养液、双抗(青霉素、链霉素)、胰蛋白酶(0.08%)、1NHCl、7.4% NaHCO3、DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油。

2

细胞冻存

1. 配制冻存培养液:配制含10% DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液。


2. 处理细胞:取对数生长期的细胞,使用胰蛋白酶将单层生长的细胞消化下来,对于悬浮生长的细胞,直接将细胞移至15ml离心管中。


3. 离心:进行1,000 rpm,5分钟的离心。


4. 调整细胞密度:去除胰蛋白酶和旧的培养液,加入适量的配制好的冻存培养液。用吸管轻轻吹打使细胞均匀,然后计数并调节冻存液中细胞的最终密度为5×10^6/ml~1×10^7/ml。


5. 分装细胞:将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml。


6. 标记冻存管:在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间及操作者。


7. 冻存过程:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min;当温度达到-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;直到-100℃时,可迅速浸入液氮中。另一种方法是将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2小时,然后放入-70℃冰箱中过夜,最后将冻存管移入液氮容器中。


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细胞冻存步骤(图片来源于网络

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细胞复苏

细胞复苏的步骤如下:


1. 取出冻存管:从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动,促使其尽快融化。


2. 处理细胞悬液:从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,将其加入离心管中,并滴加10倍以上的培养液,然后混匀。


3. 离心:进行1,000 rpm,5分钟的离心。


4. 调整细胞密度:弃去上清液,加入含10%小牛血清的培养液以重悬细胞。进行计数,调整细胞密度后,将其接种到培养瓶中,并置于37℃培养箱中,静置培养。


5. 继续培养:次日更换一次培养液,继续进行培养。


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细胞复苏方法(图片来源于网络)


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细胞冻存、复苏注意事项


1. 确保细胞状态良好:在冻存之前,确保细胞具有良好的形态,并且没有污染。


2. 选择适合的冻存液:根据细胞类型选择合适的冻存液,并按照相应的操作规程进行细胞的冻存。


3. 控制细胞密度:要控制好细胞的密度,避免过低或过高影响冻存效果。不同的冻存液针对不同细胞有适当的冻存密度范围,以确保细胞在冷冻和复苏过程中的存活率。


4.尽快冷冻:细胞悬液加入冻存液后尽量短时间在常温放置,因为常温下DMSO对细胞会造成损伤。建议尽快通过程序降温或一步法等方式进行细胞的冷冻保存。


5. 合理存放:细胞长期存放在-80℃冰箱时,建议靠冰箱内侧放置样本,避免开关冰箱导致温度不稳定影响细胞保存效果。


6. 检测存活率:细胞冻存后应取出一管进行复苏,并检测细胞的存活率。为稳妥起见,可在细胞冻存半年后进行复苏培养,并观察细胞生长情况后继续冻存。


7. 温和解冻:使用适当的方法解冻细胞,如将冻存管放入37°C的水浴中直至完全解冻。避免使用高温或暴露时间过长的方法,以减少DMSO对细胞的毒性作用。


8. 匀速摇晃:细胞融解过程应匀速、均一地摇晃以加速融解,同时避免流体剪切力对细胞的损伤。


9.尽快去除DMSO:已融解的冻存细胞应尽快在常温下存放,并尽快离心去除DMSO。