在医学和生命科学领域，免疫组化实验是一项至关重要的技术，其在疾病诊断、分子生物学研究以及药物开发中发挥着不可替代的作用。

通过利用抗体与特定抗原之间的高度特异性结合，免疫组化实验能够精确地定位、定性和定量目标蛋白在组织或细胞中的表达情况。本文将深入探讨免疫组化实验的原理、应用、检测对象，以及常见的问题和建议。

具体步骤(石蜡切片)

1）、石蜡切片脱蜡至水：
依次将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ 10min——环保型脱蜡液Ⅱ 10min——环保型脱蜡液Ⅲ 10min——无水乙醇Ⅰ 5min——无水乙醇Ⅱ 5min——无水乙醇Ⅲ 5min——蒸馏水洗。

2）、抗原修复：
将切片浸没在盛满1×柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min、停火8min、中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3）、阻断内源性过氧化酶：将切片放入3%双氧  水溶液，室温避光孵育25min。将玻片置于PBS（PH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4）、画圈：切片甩干后，组化笔在组织周围画圈。

5）、血清封闭：滴加3% BSA牛血清白蛋白，封闭30min。

6）、加一抗：轻轻甩掉封闭液，滴加稀释好的一抗，平放于湿盒内4℃孵育过夜。

7）、加二抗：将切片浸没在置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加对应的HRP标记的二抗，室温孵育50min。

8）、DAB显色：将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB工作液，显微镜下观察，出现适宜棕黄色阳性，用水冲洗终止显色。

9）、复染细胞核：将切片放入苏木素染液复染3min左右，用水冲洗，接着用苏木素分化液分化数秒，用水冲洗，最后用苏木素返蓝液进行返蓝，用水冲洗。

10）、脱水封片：依次将切片放入无水乙醇Ⅰ5min——无水乙醇Ⅱ 5min——无水乙醇Ⅲ 5min——无水乙醇Ⅳ 5min——环保型脱蜡液 5min，拿出来晾干，用中性树胶封片。

结果分析

正常的结果应该是：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。

结果分析的两种方法是阳性细胞计数法和评分法。在阳性细胞计数法中，使用40倍镜下的光学显微镜，在随机选择的10个视野下计数阳性着色细胞的数量。而评分法则是在光学显微镜下，根据染色程度（0分代表无着色，1分代表淡黄色，2分代表浅褐色，3分代表深褐色）和阳性范围（1分表示0-25%，2分表示26-50%，3分表示51-75%，4分表示76-100%），对细胞进行评分，并将染色程度和阳性范围的分数相加得到最终分数。

免疫组化结果分析

1）、对照染色：与实验中设立对照组类似，免疫组化也必须进行对照染色，缺乏对照的结果不可靠。通常包括阳性组织对照、阴性组织对照、阴性试剂对照和自身对照，其中一个阳性组织和一个阴性组织对照足够。

2）、定位：抗原表达应在特定部位，例如，LCA应定位在细胞膜上，CK应在细胞浆内，PCNA和p53蛋白应在细胞核内。未在抗原所在部位呈阳性着色不能视为确切阳性结果，可能是非特异性染色或假阳性。若存在不确定性，需使用上述提到的对照染色。

3）、半定量：现今通常使用图像分析系统进行定量，但如果实验室条件有限，可使用肉眼进行半定量评估。免疫组化的半定量通常分为三级：弱（+）、中（++）、强（+++）。观察5-10个高倍视野（HPF），根据弱（+）=1、中（++）=2、强（+++）=3进行评分。通过计算（+）% × 1 +（++）% × 2 +（+++）% × 3得出数值，总值<1.0为（+），1.0-1.5为（++），>1.5为（+++）。

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4）、图像分析仪：进行精确定量需要使用图像分析仪，有多种类型可选择。推荐一款免费软件：Image J，该软件简洁易用，可满足一般免疫组化结果分析需求。

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