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什么是电泳？
电泳是一项利用电流根据DNA、RNA或蛋白质的物理性质（例如大小和电荷）进行分离的技术。
02 什么是琼脂糖凝胶电泳？
琼脂糖凝胶电泳是一种基于核酸（如DNA）分子大小的分离和识别技术。在这项技术中，不同大小的DNA片段被加载到由红藻提取的碳水化合物琼脂糖制成的多孔凝胶上。在施加电场的情况下，DNA片段在凝胶中移动，较小的片段移动速度较快，而较大的片段则移动较慢。通过与一系列已知大小的DNA片段（称为DNA分子量标准样）位置的比较，可以准确确定分子的大小。然而，对于RNA而言，由于可能存在多种二级结构，其迁移方式变得复杂，因此琼脂糖凝胶在RNA大小分析方面不太适用。可行的替代方法包括RNA印迹法和变性琼脂糖凝胶电泳，因为它们使用的条件可以破坏RNA的二级结构。此外，琼脂糖凝胶也可用于根据蛋白质的大小和电荷进行分离，尽管它的孔径较大，因此通常使用聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质分离，以提供更高的分辨率，特别适用于小蛋白质分子。
03 工作原理
琼脂糖，作为琼脂的成分之一，构成了一个立体的凝胶基质，由螺旋状的琼脂糖分子组成。这些螺旋状的分子通过氢键在超线圈束中紧密固定，形成通道和孔隙，使分子能够穿过。在加热的过程中，这些氢键断裂，导致琼脂糖从凝胶状态变为液体状态，使其可以在恢复形状前被倒入模具。
【图片1】琼脂糖凝胶中的孔隙形成和温度诱导的状态转变。
凝胶中琼脂糖的含量直接调控了孔隙的尺寸，进而影响了分子的可透过性和迁移速度。百分比较高的琼脂糖使孔径减小，因而只有较小的分子可以通过，其迁移速度也较慢。
在分子生物学实验室中，常使用0.7~1%的琼脂糖凝胶进行日常DNA分离。这种凝胶对0.2-10kb范围内的片段提供了明显而清晰的分辨率。较大的DNA片段可以采用较低百分比的凝胶，但会变得易碎难处理，而较高百分比的凝胶则能更好地分辨小片段，但可能凝固不均匀。
鉴于DNA在肉眼中无法直接观察，因此在凝胶凝固时会加入一种夹层染料，如溴化乙锭（EtBr），以渲染凝胶。该染料会与DNA结合，并在紫外线照射下发出荧光，使得DNA片段成为可见。DNA的存在越多，相应的条带就会越亮。
与加载染料混合的样本被放置在凝胶的一端，凝胶被浸泡在运行缓冲液中。然后电流通过凝胶槽两端的电极穿过凝胶。
在样品充分分离后，将凝胶从槽中取出，置于紫外光箱上。夹层染料使得样品的条带可见，通过与已知大小的DNA标记进行比较，可以确定其尺寸。由于迁移距离和片段大小之间存在非线性关系，因此包含尺寸标记是至关重要的，可用作指导分析的依据。
A）图片左侧描述了DNA电泳的典型结果。在左边，有一个尺寸标记，用来作为样品DNA片段长度（以碱基对为单位）的参考。标记的右边是三个样品。图片显示了较小的DNA片段如何在琼脂糖凝胶中比较大的DNA片段移动得更远。
B) 图片右侧的图表显示了DNA片段的大小与迁移距离之间的非线性关系。这是一条负的曲线，当DNA片段变大时，它们在凝胶中迁移的距离就会减少。
04 实验材料
DNA、琼脂糖、TBE电泳缓冲液、电泳载样缓冲液、溴化乙锭(EB)溶液母液、 DNAGreen、水平式电泳装置、电泳仪、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、微波炉或电炉、紫外透射仪、照相支架、照相机及其附件。
05 实验步骤
1.试剂配制 5×TBE缓冲液：450 mmol/L Tris-硼 酸，10 mmol/L EDTA，pH值8.0。使用时将上述储存液稀释10倍至0.5×TBE缓冲液，可同时作为电泳及制胶用的缓冲液。 2.制胶 制胶的过程如下： 1. 根据需要的凝胶量和浓度，在含有一定量电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉（总体积不超过锥瓶容量的50%）。 2. 在锥瓶口盖上保鲜膜或牛皮纸，并在膜或纸上扎小孔，然后将其放入微波炉加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液开始沸腾时，戴上防热手套小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。重复此操作直至琼脂糖完全溶解。 3. 将溶液冷却至约50℃-60℃，可在此时加入溴化乙锭溶液（终浓度0.5 μg/ml）或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混匀。 4. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后插入梳子到适当位置。凝胶厚度一般在3~5 mm之间。小胶需要约25-30 mL的琼脂糖溶液，而大胶则需要约60-70 mL。如果需要切割和回收胶，可以适当增加凝胶厚度。 5. 在室温下等待约30分钟~1小时，直至凝胶完全固化。 3.上样 上样的步骤如下： 1. 取适量样品，并与6×上样缓冲液混合均匀（例如，1 μl样品与5 μl 6×上样缓冲液），然后用微量移液枪小心地将混合液加入样品槽中。 2. 根据样品浓度可以适当调整上样量。如果样品中DNA含量较低，可以按照上述比例增加上样量，但总体积不得超过样品槽的容量限制（通常小孔最多为40 μl，大孔最多为200 μl，具体限制取决于制胶膜的规格）。 3. 每加完一个样品后要更换微量移液枪头，以防止样品间相互污染。在上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。 4.电泳 进行电泳的步骤如下： 1. 在加完样品后，盖上电泳槽盖，并立即接通电源。控制电压保持在110 V，电流维持在40 mA以上。 2. 当条带移动到距离凝胶前沿约2 cm的位置时（大约40分钟左右），停止电泳。 3. 使用紫外线下拍照并观察结果。
实验过程
06 注意事项
以下是琼脂糖凝胶电泳实验的技巧和注意事项： 以下是关于琼脂糖凝胶电泳的技巧和注意事项： 1. 使用水替代凝胶缓冲液或电泳缓冲液是不可取的。通常，琼脂糖凝胶制备和电泳需要使用TAE或TBE缓冲液。如果使用水，凝胶在电泳过程中会迅速融化。因此，在凝胶配制时，请检查容器标签以确保使用正确的缓冲液。 2. 使用错误浓度的琼脂糖也会影响实验结果。标准的DNA凝胶电泳所需琼脂糖浓度为1.0%。浓度越高，可以获得更高分辨率的小片段；反之，浓度越低，可以获得更高分离程度和分辨率的大片段。使用错误浓度的琼脂糖凝胶会使DNA条带的可靠性受到影响。注意，低百分比浓度的琼脂糖凝胶往往较软，更容易破损。 3. 注意正确连接电泳槽与电源连接线的方向。如果不小心颠倒连接线的方向，样品会朝相反方向移动，导致样品丢失。 4. 选择适合您实验的正确缓冲液非常重要。常用的缓冲液类型包括TAE和TBE，选择取决于DNA片段大小和实验后的应用。 5. 为了获得最佳分辨率，需要根据DNA含量确定上样量。最小可检测的DNA量取决于使用的染色方法，例如使用SYBR Safe DNA凝胶染色可以检测到3 ng的DNA。 6. 凝胶的配制会影响条带的分辨率。推荐的凝胶厚度为3-4 mm，过厚的凝胶会产生模糊的条带和较高的染色背景。梳齿的厚度也很重要，薄梳会产生清晰的条带，而厚梳会导致分辨率降低。 7. 凝胶类型会影响DNA的分辨率，根据实验需求选择合适的琼脂糖类型。 8. 选择适当的电泳运行条件很重要，包括电压和距离。推荐的电压范围是4–10 V/cm，电压太低会降低迁移率，电压太高会降低分辨率。 9. 如果DNA条带呈微笑状或波浪形，可以尝试提高灌胶温度、使用小分子核酸染料，或者在电泳结束后进行染色处理。
09 其他
1.琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围：
